Het uitvoeren van een TLC-experiment begint met het plaatsen van een kleine druppel vloeibare analyt op de bodem van het TLC-plaatje. Dit wordt "spotten" van het TLC-plaatje genoemd. Zeer dunne glazen buisjes worden gewoonlijk als spotters gebruikt.
Zodra een plaat is gespot, wordt hij in een glazen recipiënt geplaatst met een kleine hoeveelheid oplosmiddel. Dit oplosmiddel wordt de mobiele fase genoemd. Het is belangrijk dat de hoogte van het oplosmiddel lager is dan de hoogte waarop de verbinding op de plaat is gespot. Als het oplosmiddel door capillaire werking langs de TLC-plaat omhoog beweegt, beweegt de verbinding ook mee. De verbinding wordt gescheiden in haar componenten op basis van de aantrekkingskracht van elke component op de stationaire fase versus de mobiele fase. Componenten die meer worden aangetrokken door de mobiele fase dan door de stationaire fase, zullen verder omhoog bewegen. De aantrekkingskrachten zijn gebaseerd op verschillen in polariteit.
De TLC-plaat moet worden verwijderd voordat het oplosmiddel de bovenkant van de plaat bereikt. Gescheiden verbindingen zullen soms gekleurd zijn, maar voor de analyse is vaak verder werk nodig. Veel verbindingen zullen oplichten wanneer het TLC-plaatje onder een ultraviolette lamp wordt geplaatst. TLC-platen worden ook vaak ondergedompeld in vlekken (zoals anisaldehyde, kaliumpermanganaat of jodium) om een verbinding op de plaat te laten verschijnen.