Hoewel New Super Mario Bros. Wii een 2D platform videospel is, zijn sommige van de personages en objecten 3D polygonale weergaven op 2D achtergronden, wat resulteert in een 2.5D effect (ook te zien in New Super Mario Bros. ) dat 3D computer graphics visueel simuleert. Spelers kunnen spelen als Mario, zijn broer Luigi, of twee Toad karakters: een blauwe en een gele (met de eerste speler altijd als Mario). De besturing is vergelijkbaar met die van New Super Mario Bros., met de extra mogelijkheden om in de lucht te draaien door met de Wii-afstandsbediening te schudden, en andere spelers op te pakken, te dragen en te gooien. In de multiplayer-stand kunnen spelers met maximaal vier spelers tegelijk spelen. Als een speler een leven verliest en ten minste één leven in reserve heeft, komt hij weer tevoorschijn in een luchtbel. Hij kan het spel hervatten zodra een andere speler hem bevrijdt door de luchtbel of een vuur- of ijsbal aan te raken (de speler kan met de Wii-afstandsbediening schudden om zijn luchtbel dichter bij een actieve speler te brengen, maar kan zichzelf niet bevrijden). Als een speler een leven verliest en geen levens meer heeft, moet een Doorgaan worden gebruikt om opnieuw te beginnen met vijf levens. Spelers kunnen zichzelf ook insluiten in de bel door op de A-toets te drukken terwijl een meer ervaren speler een moeilijk segment doorkruist. Als elk personage in een coöp-sessie op hetzelfde moment in de bubbels terechtkomt (door de dood of door op de A-knop te drukken), is het level verloren en moeten ze opnieuw beginnen.
In multiplayer mode, als één of meer spelers de leider niet bijhouden, zal op sommige levels het zicht een beetje uitwaaieren zodat de achterste speler(s) nog steeds in beeld is/zijn. Als de spelers elkaar dan nog niet inhalen, worden ze aan de rand van het scherm meegesleurd, totdat ze sneller vooruit komen of een leven verliezen door een val of een ander voorwerp. Als een speler een pijp in gaat, een liaan beklimt, de vlaggenmast aan het eind van het level grijpt, enz. zonder de anderen, zullen de andere spelers na korte tijd naar dezelfde plaats warpen, of hebben een beperkte hoeveelheid tijd om de paal te grijpen voordat het level eindigt. Op verticaal scrollende parcours, resulteert links onder het scherm in het verliezen van een leven. Op de wereldkaart bestuurt Mario (speler 1) de navigatie.
Spelers keren terug naar het kaartscherm als hun levens op zijn, of als alle spelers tegelijk hun levens verliezen en er niemand meer over is om ze te bevrijden. Voor de meeste levels is er een vlag halverwege die, als hij wordt aangeraakt, de speler terugbrengt naar dat punt nadat hij is gestorven en teruggestuurd naar het kaartscherm. Het level wordt uitgespeeld als minstens één speler het doel aan het eind aanraakt, maar er wordt een bonus toegekend als alle spelers erin slagen de vlag te pakken binnen drie seconden nadat de eerste speler hem heeft gepakt. In een paar levels is er naast het normale doel en de vlaggenmast een alternatieve uitgang die leidt naar een rode vlaggenmast. Als je dit doel bereikt, opent zich een nieuw pad op de kaart, dat leidt naar nieuwe levels op de kaart boven de wereld en soms naar een warp-kanon (dat de speler naar een andere wereld schiet). Het spel heeft geen online multiplayer. In de singleplayer-mode stuurt het verliezen van een leven de speler terug naar het kaartscherm.
Naast de gebruikelijke voorwerpen uit de Mario-serie en de Mini Mushroom uit New Super Mario Bros. zijn er nieuwe voorwerpen toegevoegd, waaronder: de Propeller Mushroom, waarmee spelers kunnen vliegen; de Ice Flower, waarmee spelers vijanden kunnen bevriezen met sneeuwballen; en het Penguin Suit, waarmee spelers naast de Ice Flower ook over de grond en door water kunnen glijden en betere controle hebben op ijs en in het water. Spelers kunnen ook op Yoshis rijden, die in bepaalde levels verschijnen en vijanden kunnen inslikken en in de lucht kunnen fladderen. Alle levels zijn toegankelijk via een kaartscherm, waar vaak vijanden rondzwerven. Als de speler er een tegen het lijf loopt tijdens zijn reis over de kaart, wordt er een "mini-baas"-gevecht gestart; als het gevecht slaagt, kunnen spelers drie extra Super Mushrooms verdienen. Er zijn ook Toad Huizen waar spelers extra levens kunnen verdienen en voorwerpen die kunnen worden uitgerust op het kaartscherm. Op sommige momenten komt er een Toad vast te zitten in een van de eerder uitgespeelde levels, en de speler kan ervoor kiezen om hem uit een blok te redden en veilig naar het einde van het level te dragen om bonuslevens te verdienen (dit kan alleen met één speler worden gedaan). In elk level zijn drie Star Coins verstopt die kunnen worden besteed aan hintfilmpjes die bepaalde geheimen laten zien, zoals de locatie van een geheim doel of hoe je oneindig veel 1-ups kunt krijgen. Als je alle Star Coins in een wereld verzamelt, ontgrendel je een level uit de geheime World 9, dat alleen kan worden gespeeld nadat het hoofdspel is uitgespeeld.
Spelmodi
Het spel kan gelijktijdig met maximaal vier spelers worden gespeeld. Naast de verhaalmodus, die zowel in single- als multiplayermodus kan worden gespeeld, zijn er twee speciale multiplayermodi. De "Free-for-All Mode" rangschikt spelers aan het einde van elk level op score, munten en vijandelijke kills; terwijl de andere mode, "Coin Battle", spelers rangschikt op het aantal verzamelde munten.
Controlesystemen
Het spel wordt gespeeld in de klassieke stijl, met de Wii-afstandsbediening horizontaal gehouden, of in de Nunchuk-stijl. De Nunchuk wordt gebruikt om te bewegen. Sommige acties, zoals springen en aanvallen, worden uitgevoerd met de knoppen, terwijl andere, zoals ronddraaien in de lucht en het oppakken van andere spelers, worden uitgevoerd door te schudden met de Wii-afstandsbediening. Bepaalde gebieden van levels, zoals specifieke platforms, kunnen ook worden gemanipuleerd door de Wii-afstandsbediening te kantelen.
Super Gids
Het spel is het eerste op de Wii met "Super Guide", een nieuw systeem bedacht door Mario-bedenker Shigeru Miyamoto. Als een speler in een level acht keer achter elkaar sterft, verschijnt er een groen "!"-blokje, waardoor een computergestuurde Luigi de speler een veilig pad door het level kan wijzen. De speler kan de gids op elk moment onderbreken en de controle overnemen. Nadat Luigi het level heeft voltooid, heeft de speler de optie om het level opnieuw te proberen, of het helemaal over te slaan. Luigi zal echter geen Star Coin locaties of geheime uitgangen onthullen. Een variatie hierop wordt gebruikt in SuperMario Galaxy 2, waar het "Cosmic Guide" wordt genoemd. Een andere variatie is te vinden in Donkey Kong Country Returns, waar het ook bekend staat als "Super Guide." spelen
