Het plot van de serie heeft te maken met het vinden van het antwoord op mysteries, oftewel X-Files. Mulder gelooft dat de antwoorden op veel van deze mysteries te maken hebben met buitenaardse wezens en het paranormale, terwijl Scully gelooft dat het antwoord kan worden gevonden met behulp van de wetenschap. Soms zijn er monsters die in de serie worden geïntroduceerd. Afleveringen met monsters worden "Monster-van-de-week"-afleveringen genoemd.
Er is een verhaal in de serie over de zus van Mulder, Samantha Mulder. Ze werd door buitenaardse wezens meegenomen toen ze klein was. Mulder is lang naar haar op zoek geweest. In seizoen zeven komt Mulder erachter dat zowel de buitenaardse wezens als de regering zijn zusje hebben meegenomen voor experimenten. Ze wilden een alien-mens hybride maken en gebruikten Samantha als proefpersoon.
Mulder en Scully geloven dat een deel van de regering de buitenaardse wezens helpt. Ze komen erachter dat dit waar is. Het deel van de regering dat de buitenaardse wezens helpt, heet "Het Syndicaat." Het Syndicaat helpt de aliens om de aarde over te nemen.
Uiteindelijk wordt Mulder meegenomen door de aliens en wordt hij in de serie vervangen door John Doggett, een andere FBI-agent. Doggett en Scully werken vervolgens samen in seizoen acht. In seizoen negen wordt Scully vervangen door Monica Reyes.
