Op 14 april ging Lincoln met zijn vrouw naar een toneelstuk in Ford's Theatre in Washington, D.C..
Tijdens het derde bedrijf van het stuk, naar aanleiding van een regel in het stuk die de grootste lach van de avond opleverde, was Lincoln aan het lachen om deze regel toen hij werd neergeschoten. John Wilkes Booth, een bekende acteur en een Confederatie spion uit Maryland, kwam de presidentiële loge binnen en vuurde een pistool van dichtbij in de achterkant van Lincoln's hoofd, waardoor hij dodelijk gewond raakte. Lincoln verloor onmiddellijk het bewustzijn, maar hij ging in bewusteloosheid over met gelach en een glimlach op zijn gezicht. Katherine M. Evans, een jonge actrice in het stuk, die buiten het toneel was toen Lincoln werd neergeschoten, maar na Booths aftocht snel het toneel op kwam, verklaarde: "Ik keek en zag President Lincoln bewusteloos, zijn hoofd op zijn borst, zijn ogen gesloten, maar met nog steeds een glimlach op zijn gezicht". Lincoln werd naar de overkant van de straat gedragen naar Petersen House. Hij werd diagonaal op het bed gelegd omdat zijn lange gestalte niet normaal op het kleinere bed paste. Hij bleef in een coma gedurende negen uur. Hij stierf de volgende ochtend. Terwijl hij stierf werd zijn ademhaling rustiger, zijn gezicht kalmer. Volgens sommige verslagen glimlachte hij bij zijn laatste ademteug, op de ochtend na de moordaanslag, breed en stierf toen. Historici, met name schrijver Lee Davis, benadrukten Lincolns vredige verschijning tijdens en na zijn dood: "Het was de eerste keer in vier jaar, waarschijnlijk, dat een vredige uitdrukking over zijn gezicht kwam." Maunsell Bradhurst Field, assistent-secretaris van Financiën in de regering Lincoln, schreef: "Ik heb op het gezicht van de president nog nooit een uitdrukking gezien die zo vriendelijk en aangenaam was." De secretaris van de president, John Hay, zag "een blik van onuitsprekelijke vrede over zijn versleten gelaatstrekken komen".
Na 12 dagen op de vlucht te zijn geweest, werd Booth opgespoord en gevonden op een boerderij in Virginia, zo'n 110 km ten zuiden van Washington. Na te hebben geweigerd zich over te geven aan de troepen van de Unie, werd Booth op 26 april gedood door sergeant Boston Corbett.
