Het spel begint met Chell die wakker wordt in een kleine glazen kamer met alleen een bed, een toilet en een radio binnenin. Ze krijgt van GLaDOS te horen dat het testen binnenkort zal beginnen, en op een van de muren opent zich een oranje portaal. Zodra de speler doorgaat, gaat ze de testkamers binnen en begint ze te testen. Er zijn in totaal 20 testkamers, die Testkamers worden genoemd.
De tests beginnen eenvoudig. Chell moet dozen, genaamd Weighted Storage Cubes (kortweg Cubes), oppakken en op knoppen zetten, die de deur naar de uitgang van de kamer openen. Op dit punt, GLaDOS spreekt met Chell als een gids, prijst haar, en belooft haar taart als de tests voorbij zijn. Aan het begin van het spel krijgt Chell het Aperture Science Handheld Portal Device, ook wel bekend als het Portal Gun. In het begin maakt haar Portal Gun alleen blauwe portalen en de oranje portalen worden gemaakt door GLaDOS. Later krijgt Chell het volledige Portal Gun en kan ze zowel blauwe als oranje portalen maken.
De tests worden steeds gevaarlijker verder in het spel. In sommige kamers ligt er gif op de vloer. In andere zijn er ballen van elektriciteit genaamd High Energy Pellets die Chell zullen doden als ze ze aanraakt. Tijdens deze tests wordt GLaDOS steeds sarcastischer en geeft Chell nutteloos advies, zoals "De vloer hier zal je doden. Probeer het te vermijden." Op een gegeven moment vertelt GLaDOS Chell dat er een kamer kapot is en dat ze door een kamer vol schildwachtkogels moet gaan, genaamd 'Turrets'. Als een revolver Chell ziet, zal hij op haar schieten tot ze sterft. In deze kamer is een verborgen kamer. In de verborgen kamer zijn tekeningen en geschriften op de muren achtergelaten door een onbekend persoon. Het schrift zegt dingen als "de taart is een leugen" en "ze kijkt altijd" met een foto van een camera. Er zijn meer van dit soort kamers in latere kamers.
In een andere kamer moet Chell de Weighted Companion Cube, die eruit ziet als een Weighted Storage Cube met hartjes erop, gebruiken om de test op te lossen. Tijdens de test vertelt GLaDOS Chell verschillende keren dat de Companion Cube niet in leven is, maar aan het einde van de test vertelt ze Chell dat ze de Companion Cube moet "doden" om bij de volgende test te komen.
Tijdens de laatste test moet Chell op een bewegend platform staan. Aan het einde van de baan van het platform zal het haar naar een vuurplaats brengen. GLaDOS bedankt Chell voor het doen van de testen. Op het laatste moment gebruikt Chell haar Portal Gun om te ontsnappen aan de valstrik. Terwijl ze probeert te ontsnappen aan het gebouw, wordt Chell naar een kamer geleid waar ze GLaDOS vindt. Chell breekt een witte bal die uit GLaDOS is gevallen. GLaDOS vertelt haar dat ze dom was om het te breken omdat ze niet wisten wat het was, maar GLaDOS komt er snel achter dat het haar moraalkern was. Ze vertelt Chell dat de mensen die voor Aperture Science werkten het hebben geïnstalleerd om haar te laten stoppen met het doden van hen met "Deadly Neuro-Toxin". Omdat Chell het brak, kan GLaDOS de Neuro-Toxin weer gebruiken. Chell heeft een tijdslimiet van 6 minuten om GLaDOS te doden voordat de Neuro-Toxine Chell doodt. Na het afbreken van stukken van haar en het verbranden ervan, wordt GLaDOS vernietigd en ontsnapt Chell aan het gebouw.
Nadat Chell ontsnapt is, valt ze flauw, en een robot sleept haar terug het gebouw in. Tijdens de aftiteling zingt GLaDOS een liedje genaamd "Still Alive" geschreven door Jonathan Coulton, dat zegt dat hoewel Chell haar vermoordde, ze nog steeds leeft.
