Röntgenkristallografie: 3D-structuur van moleculen via röntgendiffractie

Röntgenkristallografie: ontdek 3D-structuren van moleculen met röntgendiffractie — niet-destructieve, nauwkeurige methode voor organische en anorganische analyses.

Röntgenkristallografie is een manier om de driedimensionale structuur van een molecuul te zien. De elektronenwolk van een atoom buigt de röntgenstraling een beetje. Dit maakt een "beeld" van het molecuul dat op een scherm te zien is. Het kan gebruikt worden voor zowel organische als anorganische moleculen. Het monster wordt daarbij niet vernietigd.

De techniek is gezamenlijk uitgevonden door Sir William Bragg (1862-1942) en zijn zoon Sir Lawrence Bragg (1890-1971). Zij wonnen de Nobelprijs voor de Natuurkunde voor 1915. Lawrence Bragg is de jongste die tot Nobelprijswinnaar werd benoemd. Hij was de directeur van het Cavendish Laboratory, Cambridge University, toen de ontdekking van de structuur van het DNA werd gedaan door James D. Watson , Francis Crick , Maurice Wilkins, en Rosalind Franklin in februari 1953.

De oudste methode van röntgenkristallografie is röntgendiffractie (XRD). Röntgenstralen worden afgevuurd op een enkel kristal en de manier waarop ze worden verstrooid levert een patroon op. Deze patronen worden gebruikt om de opstelling van de atomen in het kristal uit te werken.

Hoe het werkt

Bij röntgenkristallografie worden röntgenstralen door een kristal gestuurd. De röntgenbundel wordt door de elektronenwolken in het kristal verstrooid en de vele verstrooide golven interfereren met elkaar. De resulterende verstrooiingspatronen (spots op een detector) hangen af van de afstand tussen atomaire vlakken in het kristal en van de positionering van de atomen.

Een eenvoudige en veelgebruikte benadering om de hoek waaronder röntgenstralen constructief interfereren te beschrijven is de Bragg-wet:

nλ = 2d sinθ

Hierin is λ de golflengte van de röntgenstraling, d de afstand tussen kristalvlakken, θ de invalshoek en n een geheel getal. Door het patroon van intensiteiten en hoeken te meten, kan men afstanden en dus atomaire posities afleiden.

Van meting naar structuur

Belangrijke stappen in het bepalen van een structuur zijn:

• Kristallisatie: voor veel moleculen (vooral eiwitten) is het verkrijgen van een goed-ordelijk kristal de moeilijkste stap.
• Dataverzameling: meten van diffractiepatronen met röntgenbronnen (laboratoriumbronnen of intensievere synchrotronbronnen) en moderne detectoren.
• Datareductie: verwerken van ruwe beelden tot een lijst van reflexen met intensiteiten en bijbehorende hoeken.
• Faseprobleem oplossen: de detector meet alleen intensiteiten (kwadraten van de amplitudes) maar verliest de fase-informatie. Methodes om fasen te verkrijgen zijn onder andere directe methoden, multiple isomorphous replacement (MIR), anomalous dispersion (SAD/MAD) en molecular replacement (MR).
• Berekenen van de elektronen-dichtheidskaart: met amplitudes en fasen kan een inverse Fouriertransformatie een driedimensionale kaart van elektronendichtheid opleveren.
• Modelbouwen en verfijnen: atomaire modellen worden in de elektronenkaart geplaatst en met statistische optimalisatie (refinements) aangepast om de berekende diffractie zo goed mogelijk aan de meetgegevens te laten voldoen.
• Valideren en rapporteren: controle van kwaliteit (resolutie in Å, R-factor, Rfree, geometriechecks) en publicatie of opslag in databanken zoals het Protein Data Bank (PDB).

Praktische aspecten en apparatuur

Voor data-acquisitie worden gebruikt: röntgenbuizen (laboratoriumopstellingen), microfocus- en roterende-anode-bronnen en krachtige synchrotronstralen. Moderne detectoren (ccd-, pixel- of hybride detectors) en cryo-koeling van kristallen (-173 °C of lager) helpen bij het verminderen van radiation damage en verbeteren de datakwaliteit.

Kwaliteitskenmerken

Belangrijke maatstaven zijn:

• Resolutie: uitgedrukt in Ångström (Å). Hoe lager het getal, hoe meer detail zichtbaar is (bijv. 1,5 Å is hoog detail; 3,5 Å is grof).
• R-factor en Rfree: maat voor hoe goed het model de gemeten data verklaart; Rfree is een onzichtbare testset en geeft een betrouwbaarder kwaliteitsbeeld.
• Electron density maps: visuele controle of atomen logisch in de dichtheidskaart passen.

Problemen en beperkingen

Hoewel röntgenkristallografie zeer krachtig is, heeft de methode beperkingen:

• Niet alle stoffen vormen gemakkelijk goede kristallen; kristallisatie van met name grote, flexibele eiwitten is uitdagend.
• Röntgenstraling kan kristallen beschadigen; daarom wordt vaak cryo-koeling toegepast en worden intensieve bronnen zoals synchrotrons met zorg gebruikt.
• Het faseprobleem is fundamenteel en vereist speciale methoden om op te lossen.
• De verkregen structuur is een gemiddelde over alle moleculen in het kristal en geeft soms geen direct inzicht in dynamiek of zeldzame conformaties.

Alternatieven en aanvullingen

Andere structurele methoden vullen röntgenkristallografie aan of vervangen haar in bepaalde gevallen:

• Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM): kan grote complexe en flexibele assemblages bestuderen zonder kristallisatie; geschikt geworden voor hoge resoluties.
• NMR-spectroscopie: geeft structuren en informatie over dynamiek in oplossing, maar is doorgaans beperkt tot kleinere eiwitten en moleculen.
• Laagseparatie- en spectroscopische methoden: complementaire informatie over binding, functie en dynamiek.

Toepassingen

Röntgenkristallografie is essentieel in veel vakgebieden:

• Structuurbepaling van biomoleculen voor fundamenteel begrip van biologische processen.
• Structure-based drug design: ontwerp van geneesmiddelen door direct te kijken hoe een ligand in het actieve centrum past.
• Materiaalwetenschappen en kristallografie van metalen, mineralen en nieuwe functionele materialen.
• Bevestiging van chemische syntheses en analyse van kleine organische en anorganische moleculen.

Geschiedenis en impact

De ontdekking van röntgendiffractie door de Braggs legde de basis voor moderne kristallografie en maakte het mogelijk grote vooruitgang te boeken in de chemie, biochemie en materiaalkunde. Een bekend historisch voorbeeld is de röntgendiffractie van DNA door Rosalind Franklin (Photo 51), die cruciale informatie leverde voor de uiteindelijke modelbouw door Watson en Crick.

Samengevat: röntgenkristallografie is een krachtige en veelzijdige methode om 3D-structuren op atomaire schaal te achterhalen. De methode vereist zorgvuldige voorbereiding en uitgebreide data-analyse, maar blijft een van de belangrijkste technieken in structurele wetenschappen.

Röntgenanalyse van kristallen

Kristallen zijn regelmatige arrays van atomen, wat betekent dat de atomen zich steeds weer herhalen in alle drie de dimensies. Röntgenstralen zijn golven van elektromagnetische straling. Wanneer röntgenstralen atomen ontmoeten, zorgen de elektronen in de atomen ervoor dat de röntgenstralen zich in alle richtingen verspreiden. Omdat de röntgenstralen in alle richtingen worden uitgezonden, produceert een röntgenstraal die een elektron raakt secundaire sferische golven die afkomstig zijn van het elektron. Het elektron staat bekend als de verstrooier. Een regelmatige reeks verstrooiers (hier het zich herhalende patroon van atomen in het kristal) produceert een regelmatige reeks sferische golven. Hoewel deze golven elkaar in de meeste richtingen opheffen, tellen ze in een paar specifieke richtingen op, bepaald door de wet van Bragg:

2 d sin θ = n λ {\\\\sin \theta =nlambda }

Hier is d de afstand tussen de diffracterende vlakken, θ de weergavestijl \theta is de invalshoek, n is een geheel getal en λ is de golflengte van de straal. Deze specifieke richtingen verschijnen als vlekken op het diffractiepatroon die reflecties worden genoemd. Röntgendiffractie is dus het resultaat van een elektromagnetische golf (de röntgenstraal) die een regelmatige reeks verstrooiers raakt (de herhalende opstelling van de atomen in het kristal).

De inkomende straal (van linksboven) zorgt ervoor dat elke verstrooier (b.v. elektron) een deel van zijn energie opnieuw uitstraalt als een sferische golf. Als atomen symmetrisch zijn gerangschikt met een scheiding d, zullen deze sferische golven alleen optellen waar hun padlengteverschil 2d sin θ gelijk is aan een veelvoud van de golflengte λ. In dat geval treedt er een reflectievlek op in het diffractiepatroon

Röntgenanalyse van kristallen

Kristallen zijn regelmatige arrays van atomen, wat betekent dat de atomen zich steeds weer herhalen in alle drie de dimensies. Röntgenstralen zijn golven van elektromagnetische straling. Wanneer röntgenstralen atomen ontmoeten, zorgen de elektronen in de atomen ervoor dat de röntgenstralen zich in alle richtingen verspreiden. Omdat de röntgenstralen in alle richtingen worden uitgezonden, produceert een röntgenstraal die een elektron raakt secundaire sferische golven die afkomstig zijn van het elektron. Het elektron staat bekend als de verstrooier. Een regelmatige reeks verstrooiers (hier het zich herhalende patroon van atomen in het kristal) produceert een regelmatige reeks sferische golven. Hoewel deze golven elkaar in de meeste richtingen opheffen, tellen ze in een paar specifieke richtingen op, bepaald door de wet van Bragg:

2 d sin θ = n λ {\\\\sin \theta =nlambda }

Hier is d de afstand tussen de diffracterende vlakken, θ de weergavestijl \theta is de invalshoek, n is een geheel getal en λ is de golflengte van de straal. Deze specifieke richtingen verschijnen als vlekken op het diffractiepatroon die reflecties worden genoemd. Röntgendiffractie is dus het resultaat van een elektromagnetische golf (de röntgenstraal) die een regelmatige reeks verstrooiers raakt (de herhalende opstelling van de atomen in het kristal).

De inkomende straal (van linksboven) zorgt ervoor dat elke verstrooier (b.v. elektron) een deel van zijn energie opnieuw uitstraalt als een sferische golf. Als atomen symmetrisch zijn gerangschikt met een scheiding d, zullen deze sferische golven alleen optellen waar hun padlengteverschil 2d sin θ gelijk is aan een veelvoud van de golflengte λ. In dat geval treedt er een reflectievlek op in het diffractiepatroon

Vragen en antwoorden

V: Wat is röntgenkristallografie?

V: Kan röntgenkristallografie voor zowel organische als anorganische moleculen gebruikt worden?

V: Wie zijn de uitvinders van röntgenkristallografie?

V: Wat is de oudste methode van röntgenkristallografie?

V: Werd het monster vernietigd tijdens het röntgenkristallografieproces?

V: Wie was de directeur van het Cavendish Laboratory toen de structuur van DNA werd ontdekt?

V: Wie is de jongste Nobelprijswinnaar voor Natuurkunde?

Zoek op letter