De Sprouses begonnen met acteren toen ze acht maanden oud waren. De tweeling acteerde voor het eerst in een reclamespotje voor luiers. Ze wisselden om de paar seconden van rol. Zoals veel tweelingacteurs hebben de twee vaak dezelfde rol gespeeld. Zo is er meer tijd om het personage te filmen. Toen ze acht maanden oud waren, speelden ze van 1993 tot 1998 in de ABC-TV-serie Grace Under Fire. Ze speelden één personage, Patrick Kelly.
In 1999 speelden de jongens in hun eerste grote film, Big Daddy. Ze deelden de rol van een vijfjarige jongen genaamd 'Julian' die wordt geadopteerd door Adam Sandler's personage, 'Sonny Koufax'. Dat jaar werkten de jongens samen met Sandler aan de tweede en derde versie van The Chanukah Song. De jongens hadden ook een kleine rol in de enge film The Astronaut's Wife. Na de release van Big Daddy begonnen de twee aan een langzame periode in hun carrière. Ze werden een tijdlang niet gecast in grote rollen. In het begin van de jaren 2000 speelde de tweeling in afleveringen van The Nightmare Room en That '70s Show. Ze acteerden ook in MADtv (seizoen vier, aflevering #425) en de film The Master of Disguise. Ze hadden ook een voice-over rol in Adam Sandler's Eight Crazy Nights. In 2001 begon Cole te acteren in afleveringen van de televisieshow Friends als Ross Gellers zoon Ben. Hij deelde deze rol niet met Dylan.
Tussen 2002 en 2003 acteerden ze beiden in I Saw Mommy Kissing Santa Claus en Just for Kicks. Beide films werden rechtstreeks op video uitgebracht. Daarna begonnen de Sprouses te acteren in de Disney Channel originele serie The Suite Life of Zack and Cody, waar ze de identieke tweeling Zack (Dylan) en Cody (Cole) Martin speelden. De serie begon in maart 2005. Het werd een kijkcijfersucces. De tweeling is zeer bekend geworden bij tieners (9 tot 12 jaar) en tieners. Als onderdeel van hun werk met Disney maakten de broers ook deel uit van de 11-koppige groep, de Disney Channel Circle of Stars. Ze zongen het nummer "A Dream is a Wish Your Heart Makes" met de leden van de groep. De videoclip werd uitgebracht als special feature in de special edition versie van de Disney film Cinderella. Ze speelden ook in de Disney Channel Games van 2006 tot 2008.
De Sprouses speelden een personage, Jeremiah, in de onafhankelijke film The Heart Is Deceitful Above All Things. De film werd geproduceerd in 2004. Hij werd pas in maart 2006 in de bioscoop vertoond. Toen speelde hij in drie theaters in de Verenigde Staten. Hij leverde 29.000 dollar op. In 2007 verfilmden de jongens A Modern Twain Story: The Prince and the Pauper. De broers Sprouse hadden beiden een stemrol in de animatiefilm Holidaze: The Christmas That Almost Didn't Happen samen met Brenda Song en Emily Osment. Dylan speelde de stem van Shasta in Disney's "Snow Buddies". De broers acteerden beiden in de film The Kings of Appletown. Deze is gebaseerd op het boek De avonturen van Tom Sawyer. Bobby Moresco regisseerde de film. Amanda Moresco schreef de film. De film werd opgenomen in New Braunfels, Texas. Hij zou oorspronkelijk in de winter van 2008 uitkomen.
In april 2009 stonden ze op de cover van People Magazine, in een speciale uitgave van tachtig pagina's over The Suite Life on Deck. De tweelingbroers begonnen in de zomer van 2009 met het filmen van een andere Modern Twain Story-film. De film kreeg de titel Sivilized. Het was een moderne versie van Huckleberry Finn. Maar midden 2010 zei Dylan dat ze de film niet zouden maken. Een deel van de reden dat ze het niet deden was omdat ze te oud werden voor de film. In maart 2009 begonnen ze reclame te maken voor Dannon Danimals. In augustus 2010 begonnen de tweelingbroers reclame te maken voor de Nintendo DS.
Vanaf begin tot midden 2011[update] acteren Dylan en Cole niet meer in shows of films. Ze besteden aandacht aan hun studie. Ook besteedt Dylan aandacht aan kunst. Cole besteedt aandacht aan fotografie. Dylan heeft gezegd dat ze allebei willen blijven acteren tijdens hun studie. Cole's oogappel was altijd zijn broer Dylan Sprouse.
