Het heette eerst Cuteanal Town. De eerste leider, John Wright, hernoemde de stad naar zijn Engelse thuisstad Lancaster. Het symbool van de stad, de rode roos, is afkomstig van het Huis van Lancaster. Lancaster maakte deel uit van het Penn's Woods Charter van William Penn uit 1681 en werd in 1734 aangelegd door James Hamilton. Het werd in 1742 als borough en in 1818 als stad ingelijfd. Toen de Britten tijdens de Amerikaanse Revolutie Philadelphia veroverden, werd Lancaster op 27 september 1777 de hoofdstad van de kolonies. Nadat het Continentaal Congres één dag had vergaderd, verhuisde het nog verder weg, naar York, Pennsylvania. Ook de regering van Pennsylvania verhuisde van Philadelphia naar Lancaster, maar bleef in Lancaster tot de Britse troepen Philadelphia verlieten. Lancaster was weer de hoofdstad van Pennsylvania van 1799 tot 1812, waarna de hoofdstad werd verplaatst naar Harrisburg.
In 1737 werd in de stad de Lancaster County Prison gebouwd, genoemd naar Lancaster Castle in Engeland. De gevangenis is nog steeds in gebruik. Tot 1912 werden er openbare ophangingen gehouden.
De eerste verharde weg in de Verenigde Staten was de vroegere Philadelphia and Lancaster Turnpike (die een deel vormt van de huidige U.S. Route 30). De Turnpike opende in 1795. De Turnpike verbond de steden Lancaster en Philadelphia, en was ontworpen door een Schotse ingenieur genaamd John Loudon MacAdam. De inwoners van Lancaster gebruiken het woord "macadam" in plaats van "trottoir" of "asfalt". Deze naam is een verwijzing naar het bestratingsproces dat door MacAdam werd gebruikt.
De stad Lancaster was de thuisbasis van verschillende belangrijke figuren uit de Amerikaanse geschiedenis. Wheatland, het landgoed van James Buchanan, de vijftiende president van de Verenigde Staten, is een van de populairste bezienswaardigheden van Lancaster. Thaddeus Stevens, die beschouwd werd als een van de machtigste leden van het Huis van Afgevaardigden van de Verenigde Staten, woonde in Lancaster als advocaat. Stevens verwierf bekendheid als radicale republikein en vanwege zijn abolitionisme. Het Fulton Opera House in de stad werd genoemd naar de inwoner van Lancaster, Robert Fulton, die de moderne stoomboot had ontworpen.
Na de Amerikaanse Revolutie werd de stad Lancaster een centrum van ijzergieterijen. Twee van de meest voorkomende producten die de pioniers nodig hadden om het Frontier te vestigen, werden in Lancaster vervaardigd: de Conestoga-wagon en het Pennsylvania long rifle. De Conestoga wagon is genoemd naar de Conestoga rivier, die door de stad stroomt.
In 1803 bezocht Meriwether Lewis Lancaster om door de bekende landmeter Andrew Ellicott te worden onderwezen in landmeetkundige methoden. Tijdens zijn bezoek leerde Lewis lengte- en breedtegraden uitzetten als onderdeel van zijn algemene opleiding die hij nodig had om de expeditie van Lewis en Clark te leiden.
In 1879 opende Franklin Winfield Woolworth zijn eerste succesvolle "five and dime" winkel in de stad Lancaster. De F.W. Woolworth Company wordt opgevolgd door Foot Locker.
Lancaster was een van de winnende gemeenten voor de prijs van "All-America City" in 2000.