Gerichte evolutie
Directed evolution (DE) is een methode die wordt gebruikt om enzymen te produceren voor industriële of medische doeleinden.
De methode is proteïnetechniek die de natuurlijke selectie nabootst.
Het basisidee is om een gen door herhaalde mutatie rondes te laten lopen, om een bibliotheek van varianten te maken. Selectie isoleert genen met de gewenste functie. Ze zijn een sjabloon voor de volgende ronde.
Dit kan in vivo (in levende cellen van bacteriën of gist), of in vitro (vrij in oplossing of microdruppels).
Het testen van meer mutanten verhoogt de kans op het vinden van een mutant met de gewenste eigenschappen.
Tijdens de in vivo evolutie wordt elke cel (meestal bacteriën of gist) getransformeerd met een plasmide dat een ander lid van de variatiebibliotheek bevat. Alleen het betrokken gen verschilt tussen de cellen, waarbij alle andere genen hetzelfde blijven.
De cellen drukken het eiwit uit in hun cytoplasma of in hun oppervlak, waar de functie ervan kan worden getest. Dit formaat heeft het voordeel om te selecteren op eigenschappen in een cellulaire omgeving, wat nuttig is wanneer het geëvolueerde eiwit of RNA in levende organismen moet worden gebruikt.
Wanneer dit wordt gedaan zonder cellen, gebruikt DE in vitro transcriptievertaling om eiwitten of RNA vrij in oplossing of binnenin kunstmatige microdruppels te produceren. Dit heeft het voordeel dat er meer condities mogelijk zijn (bijv. temperatuur, oplosmiddelen). Het kan eiwitten uitdrukken die giftig zouden zijn voor de cellen. Bovendien kunnen in vitro evolutie-experimenten veel grotere bibliotheken genereren (tot 1015) omdat het bibliotheek-DNA niet in de cellen hoeft te worden ingebracht. Dat beperkt vaak de mogelijkheden.
Een voorbeeld van gerichte evolutie met vergelijking met natuurlijke evolutie. De binnenste cyclus toont de drie stadia van de gerichte evolutiecyclus met tussen haakjes het nagebootste natuurlijke proces. De buitenste cirkel toont stappen in een typisch experiment. De rode symbolen geven functionele varianten aan, de bleke symbolen geven varianten met een gereduceerde functie aan.
Het verzekeren van erfelijkheid
Wanneer functionele eiwitten zijn geïsoleerd, is het noodzakelijk dat hun genen ook zijn, daarom is een genotype-fenotype link nodig.
Dit kan covalent zijn, waarbij het mRNA-gen aan het einde van de vertaling door puromycine aan het eiwit wordt gekoppeld.
Als alternatief kunnen het eiwit en zijn gen bij elkaar worden gehouden, of in emulsiedruppels. De geïsoleerde gensequenties worden dan vermenigvuldigd met PCR of met getransformeerde gastheerbacteriën. De ene beste sequentie, of een pool van sequenties kan worden gebruikt als sjabloon voor de volgende mutageneseronde. De herhaalde cycli van diversificatie-selectie-selectie-amplificatie maken enzymvariaties aangepast aan het selectieproces.
Een tot expressie gebracht eiwit kan covalent gekoppeld worden aan zijn gen (zoals in mRNA), links, of er in hetzelfde compartiment mee worden gezet, rechts. Hoe dan ook, het gen dat codeert voor het eiwit wordt geïsoleerd
Prijs toegekend
De Amerikaanse ingenieur FrancesArnold heeft de Millennium Technology Prize gewonnen voor baanbrekende gerichte evolutie.
Vragen en antwoorden
V: Wat is gerichte evolutie?
A: Gerichte evolutie (DE) is een methode die wordt gebruikt om enzymen te produceren voor industriële of medische doeleinden. Het is een vorm van proteïne-engineering die natuurlijke selectie nabootst.
V: Hoe werkt gerichte evolutie?
A: Gerichte evolutie werkt door een gen herhaalde mutatierondes te laten ondergaan, waardoor een bibliotheek van varianten ontstaat. Selectie isoleert dan genen met de gewenste functie, die vervolgens worden gebruikt als sjabloon voor de volgende ronde.
V: Waar kan gerichte evolutie plaatsvinden?
A: Gerichte evolutie kan in vivo plaatsvinden (in levende cellen van bacteriën of gist), of in vitro (vrij in oplossing of microdruppels).
V: Wat zijn de voordelen van gerichte evolutie in vivo?
A: Gerichte evolutie in vivo heeft het voordeel dat er geselecteerd wordt op eigenschappen in een cellulaire omgeving, wat nuttig is wanneer het geëvolueerde eiwit of RNA gebruikt moet worden in levende organismen.
V: Wat zijn de voordelen van gerichte evolutie in vitro?
A: Gerichte evolutie in vitro heeft het voordeel dat er meer omstandigheden mogelijk zijn (bv. temperatuur, oplosmiddelen) en dat er eiwitten tot expressie kunnen worden gebracht die giftig zouden zijn voor cellen. Bovendien kunnen veel grotere bibliotheken worden gegenereerd omdat er geen DNA in de cellen hoeft te worden ingebracht.
V: Wat beperkt de mogelijkheden van een in vitro experiment?
A: De groottebeperking van wat tijdens een in vitro experiment kan worden gedaan, wordt vaak bepaald door de hoeveelheid DNA die in de cellen moet worden ingebracht.
