Lynch verbleef vijftien jaar in
Chicago, waar ze acteerde in de Steppenwolf Theatre Company en toerde met The Second City comedy troupe. Ze speelde Carol Brady in
The Real Live Brady Bunch. Ze schreef en speelde ook in het bekroonde toneelstuk
Oh Sister, My Sister.
Haar doorbraak in de film was als Christy Cummings, de butch lesbische hondenuitlater van trophy wife Sheri Ann Cabot (Jennifer Coolidge) in Christopher Guest's mockumentary Best in Show (2000). Ze was ook te zien in Guest's A Mighty Wind (2003) als pornoactrice-turned-folkzangeres Laurie Bohner en in For Your Consideration (2006) als een entertainmentverslaggeefster.
Lynch is ook een televisie-actrice. Ze speelde samen met John Hannah en William Fichtner in MDs uit 2002, en heeft gastrollen gespeeld in vele televisieprogramma's, waaronder L.A. Law, Judging Amy, The West Wing, 7th Heaven, Friends, Dawson's Creek, Felicity, Arrested Development, Lovespring International, Two and a Half Men, Weeds, Boston Legal, The L Word, Criminal Minds, Help Me Help You, Gilmore Girls, The New Adventuresof Old Christine, Psych, Monk en Party Down, onder anderen.
In 2005 werd Lynch genoemd als een van POWER UP's "10 Amazing Gay Women in Showbiz".
Publiek en critici merkten Lynch op voor haar eigenaardige rol in Judd Apatow's The 40-Year-Old Virgin. Ze vertelde Terry Gross van Fresh Air dat de rol oorspronkelijk voor een man was bedoeld, maar op aandringen van Nancy Walls, de vrouw van Steve Carell, aan Lynch werd aangeboden. Sindsdien speelde ze in een reeks films, waaronder Role Models, Talladega Nights: The Ballad of Ricky Bobby, Alvin & the Chipmunks, Walk Hard: The Dewey Cox Story, Space Chimps, The Rocker, The Hammer, Another Cinderella Story, Ice Age: Dawn of the Dinosaurs, en Spring Breakdown.
In Julie and Julia speelde zij de rol van Dorothy McWilliams, de zus van Julia Child. Entertainment Weekly wijdde een artikel op hun website aan de mogelijkheid dat haar optreden een nominatie voor een Academy Award zou krijgen.
Begin 2009 was Lynch te zien in de Fox-show Glee. Ze kreeg lovende kritieken voor haar rol als de agressieve cheerleading coach Sue Sylvester. Mary McNamara van de LA Times schreef: "Lynch alleen al maakt Glee het kijken waard." Voor haar werk in Glee, was ze een vaste rol in de Starz komedie Party Down. Hoewel de serie werd verlengd voor een tweede seizoen, zou Lynch niet terugkeren vanwege haar werk voor Glee. Op 15 december 2009 ontving Lynch een Golden Globe nominatie voor Beste Bijrol in een Serie, Miniserie, of Televisiefilm voor haar rol in Glee. Ze verloor van Chloë Sevigny. De serie zelf kreeg ook nominaties in drie andere categorieën. Op 29 augustus 2010 won Lynch de Primetime Emmy Award voor Outstanding Supporting Actress - Comedy Series.
Lynch presenteerde Saturday Night Live op 9 oktober 2010; het nieuws van haar optreden werd per ongeluk per sms aan haar onthuld door haar Glee baas, Ryan Murphy. Lynch speelde ook een gastrol in de Nickelodeon show iCarly als Pam Puckett, de moeder van Sam Puckett, in de aflevering iSam's Mom.
Lynch verscheen op de 2010 MTV Video Music Awards op 12 september 2010.
In januari 2011 werd Lynch bekroond met de Golden Globe in The Best Supporting Actress in a Series, Miniseries, or Television film Catergory. Ze begon ook te verschijnen in de XFinity reclames van Comcast die zowel op het internet als op televisie te zien zijn in de Verenigde Staten, voornamelijk met twee verschillende laptops en twee verschillend gekleurde Perzische katten.
