In 1606 werd de Smith ingehuurd door de Virginia Company om zich met winstoogmerk in de kolonie Virginia te vestigen. Ze vertrokken in drie schepen, in december 1606. Smith had een bediende genaamd Samuel Collier. Samuel Collier zou het grootste deel van de reis bij hem blijven.
Er waren problemen op de reis en Smith werd beschuldigd van muiterij. Kapitein Newport was van plan hem te executeren. De kapitein opende een brief met orders van de Virginia Company waarin stond dat Smith een van de leiders van de nieuwe kolonie zou zijn, dus Smith werd niet gedood.
De Engelsen arriveerden in april 1607 en kapitein Wingfield koos Jamestown als locatie voor de kolonie. In de zomer woonden de kolonisten nog in tijdelijke behuizing. Na de oceaanreis van vier maanden was de voedselvoorraad slechts voldoende voor een of twee kopjes graanmeel per dag. Door het weer en het gebrek aan voedsel verspreidden ziekten zich onder de mensen en in september stierf meer dan de helft.
In december 1607 was Smith op zoek naar voedsel en werd hij gevangen genomen door Indianen. Hij werd meegenomen om het opperhoofd van de Powhatan-stam te ontmoeten. Het dorp lag ongeveer 15 mijl van Jamestown. Smith werd zonder schade vrijgelaten en had dit mede te danken aan de dochter van het opperhoofd, Pocahontas, die zich over zijn lichaam wierp. Toen ze dit zag, kreeg haar vader medelijden met Smith en werd hij veilig teruggebracht naar Jamestown. Met deze ontmoeting begon een vriendschappelijke relatie tussen de inboorlingen, Smith en de kolonisten in Jamestown. Begin januari 1608 arriveerden bijna 100 nieuwe kolonisten met kapitein Newport, en door onachtzaamheid werd het dorp in brand gestoken. Die winter bevroor de James River, en de kolonisten werden gedwongen in de ruïnes te leven. In die tijd verspilden Newport en zijn bemanning veel tijd met het laden van hun schepen met ijzerpyriet (goud voor de gek). De voedselvoorraden raakten uitgeput en hoewel de Indianen wat voedsel meebrachten, schreef Smith dat "meer dan de helft van ons stierf".
In april 1608 bracht een schip voorraden en 50 nieuwe kolonisten, die Smith aan het werk zette om huizen te bouwen en gewassen te planten.
In de zomer van 1608 verliet Smith Jamestown om het Chesapeake Bay-gebied te verkennen en op zoek te gaan naar broodnodig voedsel. Hij maakte een kaart die meer dan een eeuw van grote waarde zou zijn voor de ontdekkingsreizigers van Virginia. In zijn afwezigheid liet Smith zijn vriend Matthew Scrivener als gouverneur achter. Scrivener zou later verdrinken in een storm tijdens een noodlottige reis naar Hog Island. Smith werd in september 1608 verkozen tot voorzitter van de plaatselijke raad en stelde strenge regels in.
In oktober 1608 arriveerde een schip met 70 nieuwe kolonisten, waaronder de eerste vrouwen. Ook enkele Duitse en Poolse ambachtslieden arriveerden, maar zij brachten geen voedselvoorraden mee. Daarna probeerde Smith voedsel te krijgen van de indianen en er was dreiging met militair geweld voor nodig om hen te laten gehoorzamen. Powhatan was bang voor het grote aantal blanken dat naar het gebied kwam en probeerde hen uit te hongeren.
Smith ontdekte dat er zowel onder de kolonisten als onder de Indianen mensen waren die zijn regels niet leuk vonden en van plan waren hem te doden. Smith schreef dat hij werd gewaarschuwd door Pocahontas. Hij riep een vergadering bijeen en vertelde de mannen die niet werkten dat "wie niet wil werken, niet zal eten...". Daarna verbeterde de situatie.
Gedurende drie maanden begin 1609, februari, maart en april, ging alles goed in Jamestown: er werden vele woningen gebouwd, hectaren land ontgonnen en veel ander werk gedaan. In april vernietigden ratten en vocht al hun opgeslagen graan. Ze hadden dringend voedsel nodig en Smith stuurde een grote groep kolonisten om te vissen en anderen om stroomafwaarts schelpdieren te verzamelen. Zij kwamen zonder voedsel terug en waren bereid het schamele rantsoen dat hen werd aangeboden aan te nemen. Dit maakte Smith woedend en hij beval hen hun geweren en gereedschap te ruilen voor fruit van de Indianen en beval iedereen te werken of ze zouden de veiligheid van het fort moeten verlaten. Sommigen vertrokken en gingen naar de indianendorpen, maar Powhatan's mensen hielden zich ook aan Smith's wet dat wie niet werkt, niet eet. Dit gold totdat ze bijna uitgehongerd waren en naar huis terugkeerden.
Op een gegeven moment arriveerde een onverwacht schip, met als kapitein Samuel Argall. Hij had voedsel en wijn bij zich, die Smith kocht met de belofte dat hij terug zou betalen. Argall bracht ook nieuws dat de Virginia Company meer voorraden en kolonisten naar Jamestown stuurde, samen met een nieuwe gouverneur, Lord De la Warr.
Tijdens een reis naar Virginia in mei 1609 zorgde Sir Thomas Smith, penningmeester van de compagnie van Virginia, ervoor dat ongeveer 500 kolonisten, waaronder vrouwen en kinderen, meegingen. Een vloot van negen schepen vertrok. Een ervan zonk in een storm kort na het verlaten van de haven. De Sea Venture leed schipbreuk op de Bermuda eilanden met de admiraal en Stephen Hopkins aan boord. Een jaar later, in mei 1610, arriveerden zij in Jamestown in zelfgemaakte bootjes. Gates ontdekte al snel dat er niet genoeg voedsel was om iedereen in de kolonie te onderhouden en besloot Jamestown te verlaten. Terwijl hun boten Jamestown verlieten, ontmoetten zij een schip met de nieuwe gouverneur, Lord De la Warr, die hen terug naar Jamestown beval.
In augustus 1609 was John Smith nogal verbaasd toen hij meer dan 300 nieuwe kolonisten zag aankomen. Londen stuurde nieuwe kolonisten zonder planning over hoe of waar ze zouden wonen.
Kapitein John Smith raakte ernstig gewond door een kruitontploffing in zijn kano. Smith voer in oktober 1609 naar Engeland voor behandeling. Hij had tweeënhalf jaar lang zijn best gedaan voor Jamestown. Hij keerde nooit meer terug naar Virginia. De geschiedenis heeft zijn grote bijdrage aan Jamestown in de beginjaren bevestigd.
De kolonisten zouden blijven sterven aan verschillende ziekten en aandoeningen; naar schatting 150 van de 500 overleefden die winter. Desondanks ging de Virginia Company door met het financieren en vervoeren van kolonisten om Jamestown in stand te houden. De volgende vijf jaar bleven de gouverneurs Gates en Sir Thomas Dale een strikte discipline handhaven, terwijl Sir Thomas Smith in Londen probeerde bekwame ambachtslieden en andere kolonisten te vinden om naar Jamestown te sturen.