Instelling
Het spel speelt zich af in dezelfde fictieve wereld als de rest van de Halo-serie. Het grootste deel van het spel speelt zich af in het toekomstige jaar 2553, over 500 jaar. In de verhaallijn hebben mensen zich sneller ontwikkeld dan licht reizen, en leven nu op vele planeten en manen van het Zonnestelsel. Toen de mensheid begon met het bouwen van een andere nederzetting op een planeet rond een andere ster ontmoetten ze het Buitenaards Verbond. Het Convenant verklaarde de mensheid de religieuze oorlog. Tijdens Halo 2 ontdekte het Convenant de Aarde. Aan het begin van Halo 3 lanceert het Convenant een grootschalige invasie van de Aarde.
De Halo van de games titel is de naam van een reeks van de ruimte super wapens gebouwd door een mysterieuze race genaamd de Forerunners een lange tijd voor het spel. De Halo's zijn de laatste verdediging tegen een ander buitenaards ras dat bekend staat als de Flood. De zondvloed wil elk levend wezen in de melkweg gebruiken voor voedsel. De Halo's zijn eigenlijk reusachtige superwapens, die, wanneer ze geactiveerd worden, al het leven in de melkweg zullen doden. Dit is de enige manier om de zondvloed te stoppen, om ze uit te hongeren door al hun voedsel te doden. Het Verbond weet dit niet en probeert de Halo's af te vuren als onderdeel van een verkeerde religieuze profetie. In het eerste Halo spel, Halo: Combat Evolved, de mensen en Master Chief erin slagen om het verbond te stoppen van het afvuren van een van de Halos. Ze vernietigen ook een van hen in het proces. De vernietiging van een van de Halo's begint een noodsituatie. De Halo's kunnen nu allemaal worden afgevuurd vanaf één plaats, met behulp van een apparaat genaamd de Ark. Het Verbond, dat nog steeds de waarheid niet begrijpt, lanceert een invasie van de Aarde, waar ze geloven dat de Ark begraven is. Dit is waar het Halo 3 verhaal begint.
Tekens
De hoofdpersoon van Halo 3 is Master Chief. Master Chief is een supersoldaat, het laatste overlevende lid van het Spartaanse Project. Het Spartaanse Project is gestart door mensen om met behulp van genen genetisch gezien soldaten te maken die sterker, sneller en taaier waren dan elke normale mens. Een ander personage uit Halo 1 en 2, gecontroleerd door de tweede speler in een co-op spel is Arbiter, de leider van de buitenaardse Elites. In Halo 2 is hij een vijand, maar in Halo 3 bundelt hij zijn krachten met de mensen. Andere terugkerende karakters zijn de veteraan mensensoldaat Avery Johnson, de AI Cortana, de robot 343 Guilty Spark en de Gravemind, gevaarlijke leider van de Flood.
Kavel
Halo 3 begint waar Halo 2 is gebleven. De speler speelt opnieuw als Master Chief als hij naar de aarde valt. Hij stort neer in Kenia bij de stad Mombasa. Hij wordt gevonden door een peloton mariniers onder leiding van sergeant Avery Johnson, de commandant van Halo en Halo 2. De speler en de mariniers vechten zich een weg door de invasie van de verbondsmacht naar een menselijke buitenpost. Hier vinden ze menselijke krachten die een laatste poging doen om het Convenant te stoppen met het activeren van een portaal dat ze begraven in de Keniaanse woestijn vonden. Ze zijn echter niet succesvol, en het Convenant opent de poort naar de Ark, waar ze in staat zullen zijn om de Halos af te vuren en de melkweg te vernietigen. Net na het verlaten van de Convenant vloot van ruimtevaartuigen de poort, een groot schip stort neer in de stad Mombasa. Dit schip is overgenomen door de zondvloed. De speler als Master Chief, moeten vechten hun weg naar de verwoeste ruimteschip en het herstel van de robot Cortana die kan vertellen hen de manier om de poort te heropenen en volg het Convenant. Als de speler eenmaal succesvol is, heropenen de mensen het portaal en gaan ze na het Convenant aan de slag om ze te stoppen met het afvuren van de Halos. Deelnemen aan hen is 343 Guilty Spark, een van de robots die hielpen bij het bouwen van de vernietigde Halo uit het eerste spel. Eenmaal door het portaal ontdekken de speler en zijn bondgenoten de enorme, planetaire structuur die bekend staat als de Ark, waar alle Halo's kunnen worden afgevuurd. Onder leiding van 343 Guilty Spark baant de speler zich een weg naar het centrum van de Ark waar de leider van het Verbond, de Profeet van de Waarheid, zich opmaakt om te vuren.
Net als de speler aankomt om de Profeet van de Waarheid te stoppen, komt het door de zondvloed geteisterde schip High Charity aan in een poging om de Ark over te nemen. De speler, Arbiter en Johnson halen nu alle Vloed in het gebied weg voordat Arbiter de Profeet van de Waarheid doodt en voorkomt dat de Halo's worden afgevuurd. Er is echter geen tijd voor de speler om te rusten, want hij moet nu naar de kernreactor in het centrum van het door de zondvloed geteisterde ruimteschip, High Charity, in een poging om de zondvloed te doden. Zodra dit is voltooid, moeten de speler en de Arbiter gaan en een Halo ring activeren. Dit zal de Ark vernietigen en alle Flood in dit gebied van de Melkweg Galaxy te doden, terwijl het redden van de rest. De speler en de Arbiter gaan er vandoor om de enkele Halo te activeren en de Melkweg te redden. Als ze aankomen 343 Guilty Spark waarschuwt hen dat het activeren van deze Halo de hele Ark en de Halo zelf zal vernietigen. De speler negeert de waarschuwing. Dit maakt 343 Guilty Spark boos. Hij doodt Sergent Johnson, en probeert Master Chief te doden om te voorkomen dat 'zijn' Halo wordt vernietigd. Dit is in feite de laatste 'boss battle' van het spel. De speler verslaat de robot, en activeert de Halo. Het aftellen begint, maar het is te laat voor de speler als Master Chief en de AI Cortana. Ze slagen erin om aan boord van een ruimteschip te gaan om ze weg te halen, maar het is gevangen in de explosie en wordt in tweeën gesplitst. Master Chief wordt verondersteld dood te zijn.
Als de speler het spel op enige moeilijkheidsgraad afrondt, zie je na de aftiteling dat de Master Chief en Cortana het hebben overleefd. Als je het spel op de "Legendarische" moeilijkheid afrondt, zie je na de aftiteling een alternatieve afloop.
