Aan het begin van de film doet het Amerikaanse leger in 1957 wapentesten in Nevada. Toen bleek dat de Sovjets een deel van het leger in handen hadden en een aantal veiligheidsmensen doodschoten. Een groep Sovjetmensen en agent Irina Spalko halen vervolgens Indiana Jones uit de auto en zorgen ervoor dat hij een voorwerp krijgt dat hij tien jaar geleden heeft gevonden. Hij vindt de doos en probeert te ontsnappen, maar zijn vriend Mac draait zich tegen hem op. Nadat hij ontsnapt is, vindt hij zichzelf in een nepstad. Het Amerikaanse leger laat dan een atoombom ontploffen. Jones stapt in een koelkast en overleeft het nauwelijks.
Omdat Jones lange tijd Mac's vriend was, denkt de Amerikaanse regering dat Jones misschien een communist is. Op het Marshall College de volgende dag (waar Jones lesgeeft) deelt de hoofddecaan hem mee dat hij met "verlof" is en dat de decaan ontslag heeft genomen om Jones te beschermen. Jones pakt zijn koffers en verlaat New York. Voordat hij kan vertrekken, komt er echter een jongeman genaamd Mutt Williams naar hem toe en laat hem een brief zien. Williams zegt dat Harold Oxley, een van Jones' oude vrienden, is ontvoerd. Later hebben deze mensen Williams' moeder Mary ontvoerd en zullen ze beiden vermoorden als de kristallen schedel niet gevonden kan worden.
Jones leest de brief en de puzzel en zegt dat Oxley verwees naar Cuzco, Peru. Jones en Williams vliegen daar naar beneden, waar Jones verneemt dat Oxley een paar maanden geleden in de gevangenis is gezet. In de gevangenis heeft Oxley wat tekeningen uitgekrast. Jones en Williams gaan naar een graflocatie waar ze geloven dat Francisco de Orellana begraven ligt; de legende vertelt dat hij de kristallen schedel heeft gevonden, maar nooit is gevonden. Ze vinden de schedel en komen alleen naar boven om Mac en enkele Sovjets te vinden die wapens op hen richten.
Ze vliegen allemaal naar een nieuw kamp in de jungle. Spalko vertelt Jones dat ze gelooft dat de schedel door buitenaardse wezens is gemaakt en dat deze grote kracht heeft. Daar vindt Jones dat "Mary Williams" eigenlijk Marion Ravenwood is, zijn oude minnaar. Hij vindt ook Oxley, die gek is, en die niet in staat is om een volledige zin te spreken. Jones komt erachter wat Oxley zegt. Als de Sovjets en Jones erachter komen waar ze heen moeten, begint Williams een vuurtje en probeert ze te laten ontsnappen. Jones en Ravenwood vallen in drijfzand en beginnen te zinken. Terwijl ze zinken, vertelt Ravenwood aan Jones dat Williams' echte naam Henry Jones III is en dat hij de zoon van Jones is. Williams gebruikt een slang om ze uit de zandbak te krijgen. Ze worden heroverd.
De volgende dag beginnen de Sovjets het bos te vernietigen terwijl ze proberen de Tempel van Aktor te bereiken, het gebied waar Oxley op wees. Jones krijgt zijn touwen los en neemt een van de auto's over, en start een lange jungle achtervolging. Uiteindelijk vinden ze het gebied, de locatie waar de kristallen schedel moet worden teruggegeven. Mac voegt zich weer bij de groep als een goede vent, maar in werkelijkheid was hij nog steeds niet goed, en liet kleine knipperende rode lichtjes achter als een spoor zodat de langzamere Sovjets kunnen vinden waar Jones en zijn partij waren.
In een kamergraf vinden Jones en zijn gezelschap die 13 kristallen skeletten, waarvan er één een schedel mist. Spalko neemt de schedel weg van Oxley en legt hem terug. De tempel begint af te brokkelen. Spalko wil alles in de wereld weten, maar ze weet al snel te veel en explodeert. Jones en zijn gezelschap beginnen te ontsnappen. Jones stopt om te proberen Mac te pakken te krijgen, maar Mac zegt dat het goed is en laat zich weghalen. Nadat Jones de tempel heeft verlaten, ziet hij de tempel instorten en onthult zich als een vliegende schotel. Terug thuis wordt Jones de adjunct-directeur van Marshall College. Hij en Ravenwood gaan trouwen.