Wanneer een gouden druppel zonlicht uit de hemel valt, groeit er een magische bloem. Moeder Gothel (Donna Murphy), een oudere heks, heeft de genezende magie van de bloem eeuwenlang bewaard om zichzelf jong te houden, en is woedend als soldaten van een nabijgelegen koninkrijk de bloem plukken en aan hun zieke, zwangere koningin geven. Daarna bevalt de koningin van een meisje, Rapunzel, wiens lange, blonde haar de genezende eigenschappen van de bloem bevat. Gothel breekt 's nachts in het paleis in om het haar van Rapunzel af te knippen en de magie opnieuw te gebruiken, maar ontdekt dat het afknippen het haar nutteloos maakt, dus steelt ze de baby en zondert haar af in een toren in het bos, waar ze haar opvoedt en tegen het meisje liegt over de gevaren van de buitenwereld om haar veilig en tevreden te houden. Ondertussen laten de koning en koningin elk jaar op Rapunzels verjaardag drijvende lantaarns los in de hoop dat hun dochter ze ziet en naar huis komt.
Rapunzel (Mandy Moore) weet dat de lantaarns voor haar gemaakt zijn en aan de vooravond van haar achttiende verjaardag verzamelt ze de moed om Gothel om toestemming te vragen om de lantaarns te zien en hun bron te ontdekken, maar ze weigert. Ondertussen steelt de bandiet Flynn Rider (Zachary Levi) in het koninkrijk Rapunzels beoogde kroon uit het paleis en laat zijn partners, de gebroeders Stabbington, in de steek terwijl zij vluchten. Hij schuilt met de kroon in de toren, maar Rapunzel slaat hem neer met een koekenpan en verstopt hem in haar kleerkast. Bij de terugkeer van Gothel probeert Rapunzel Flynn aan haar te laten zien om haar te overtuigen dat ze klaar is voor de "gevaarlijke" wereld, maar ze wordt toch afgewezen.
Rapunzel stuurt Gothel drie dagen weg om wat verf voor haar op te halen. Als Gothel vertrekt, verbergt Rapunzel de kroon voor Flynn en gebruikt die als pressiemiddel om hem zover te krijgen dat hij haar op haar verjaardag meeneemt naar de lantaarns. Op hun reis stoppen Flynn en Rapunzel bij de Snuggly Duckling, een taverne vol dreigende barbaarse schurken, die Flynn aanvankelijk proberen te vangen, maar Rapunzel charmeert hen. Ondertussen komt Gothel Maximus tegen, een paleispaard dat Flynn achtervolgt. Gothel realiseert zich dat de paleiswachten de toren in zicht krijgen en haast zich terug om te ontdekken dat Rapunzel ontbreekt, maar ze vindt Flynns tas met de kroon en gaat achter het paar aan.
De soldaten, geleid door Maximus, zoeken Flynn in de taverne. Rapunzel en Flynn ontsnappen via een geheime gang, maar komen vast te zitten in een overstroomde grot. Flynn onthult dat zijn echte naam Eugene is en Rapunzel onthult dat haar haar gloeit als ze zingt. Met het licht van Rapunzels haar ontsnappen ze uit de grot en schuilen ze in het bos. Ondertussen werkt Gothel samen met de Stabbingtons en geeft de kroon aan Rapunzel als test voor Flynns loyaliteit.
De volgende ochtend arriveert Maximus om Flynn te arresteren, maar Rapunzel haalt hem over om een wapenstilstand met hem te sluiten voor haar verjaardag. Rapunzel en Flynn komen aan in het koninkrijk en genieten van de festiviteiten, met als hoogtepunt een avondlijke boottocht waarbij de koning, de koningin en de burgers lantaarns loslaten. Als dank voor het vervullen van haar droom om de lantaarns te zien, geeft Rapunzel Flynn de tas met de kroon. Ze bekennen hun liefde, en net als de twee op het punt staan te kussen, ziet Flynn de Stabbingtons aan de oever van het meer, en hij roeit de boot over om zich te verontschuldigen en de kroon aan hen te overhandigen. De broers vallen hem echter aan en binden hem vast aan een boot die op weg is naar het paleis. Terwijl Flynn door de bewakers in hechtenis wordt genomen, zorgt Gothel voor een redding door de broers uit te schakelen, en keert terug naar de toren met Rapunzel.
Terug in de toren ontdekt Rapunzel het zonnesymbool van het koninkrijk dat zij door de jaren heen onbewust in haar kunstwerken heeft verwerkt, en realiseert zich dat zij de vermiste prinses is voor wie het koninkrijk de lantaarns heeft vrijgegeven, en confronteert Gothel boos. Ondertussen bevrijden Maximus en de schurken Flynn, die terugrijdt naar de toren en naar binnen gaat, waar hij ontdekt dat Rapunzel geketend en gekneveld is. Nadat ze Flynn heeft neergestoken en hem aan zijn verwondingen heeft laten sterven, probeert Gothel te vluchten met de gevangen Rapunzel, die ermee instemt dat ze met Gothel meegaat als ze vrij is om Flynn te genezen. Flynn wil niet dat ze nog langer een gevangene is en knipt Rapunzels haar, waardoor het bruin wordt en haar krachten verdwijnen. Gothel veroudert snel, valt uit het raam van de toren en wordt gereduceerd tot as.
Flynn bekent zijn liefde voor Rapunzel en sterft aan zijn verwondingen. Terwijl de gebroken Rapunzel rouwt, brengen haar tranen, doordrenkt met genezende magie, Flynn weer tot leven. Wanneer de twee terugkeren naar het koninkrijk, wordt Rapunzel herenigd met haar ouders, die Eugene vergeven. Het koninkrijk verheugt zich, en na enige tijd trouwen Rapunzel en Flynn.