Gaschromatografie-massaspectrometrie

Geschiedenis

De eerste onderzoekspapers over gas-vloeistofchromatografie werden gepubliceerd in 1950. Scheikundigen gebruikten verschillende detectoren om te zien dat er verbindingen uit het uiteinde van de chromatograaf vloeiden. De meeste detectoren vernietigden de verbindingen, omdat ze ze verbrandden of ioniseerden. Deze detectoren lieten de chemici de exacte identiteit van elke verbinding in het monster raden. In de jaren vijftig ontwikkelden Roland Gohlke en Fred McLafferty een nieuwe gecombineerde machine. Ze gebruikten een massaspectrometer als de detector in de gaschromatografie. Deze vroege apparaten waren groot, fragiel en oorspronkelijk beperkt tot laboratoriuminstellingen.

Het ontwerp was complex. Het tijdsinterval tussen de verschillende verbindingen die uit de chromatograaf vloeiden was moeilijk te controleren. De massaspectrometer moest dus de ene verbinding afmaken voordat de volgende uit de chromatograaf stroomde. In de vroege modellen werden de metingen van de massaspectrometer opgenomen op grafiekpapier. Hoogopgeleide chemici bestudeerden de patronen van de pieken om elke verbinding te identificeren. In de jaren zeventig werden analoog-digitaal omzetters toegevoegd aan de massaspectrometers. Hierdoor konden computers de resultaten opslaan en interpreteren. Naarmate computers sneller en kleiner werden, werd GC-MS sneller en verspreidde zich vanuit laboratoria naar het dagelijks leven. Vandaag de dag worden computergestuurde GC-MS instrumenten op grote schaal gebruikt bij de milieubewaking van water, lucht en bodem. Het wordt ook gebruikt bij de regulering van de landbouw, de voedselveiligheid en bij de ontdekking en productie van medicijnen.

De ontwikkeling van kleine computers heeft bijgedragen aan de vereenvoudiging van GC-MS machines. Het heeft ook de tijd die nodig is om een monster te analyseren sterk verminderd. Electronic Associates, Inc. (EAI) was een toonaangevende Amerikaanse leverancier van analoge computers. In 1964 begon EAI met de ontwikkeling van een computergestuurde massaspectrometer onder leiding van Robert E. Finnigan. In 1966 werden meer dan 500 gas-analyzer instrumenten verkocht. In 1967 werd de Finnigan Instrument Corporation (FIC) opgericht. Begin 1968 werd het eerste prototype van quadrapole GC-MS instrumenten geleverd aan Stanford en Purdue University. FIC werd uiteindelijk omgedoopt tot Finnigan Corporation en vestigde zich als wereldwijde leider in GC-MS systemen.

Basisbediening

GC-MS kan alle verbindingen samen in een monsterobject vinden. De operator lost het monster op in een vloeistof. De operator injecteert de vloeistof vervolgens in een gasstroom. (Meestal wordt helium-, waterstof- of stikstofgas gebruikt.) Het gas stroomt door een buis met een speciale coating. Omdat elke verbinding in het monster op een andere manier aan de coating kleeft, komt elke verbinding op een ander moment uit de buis. De coating wordt dus gebruikt om elke verbinding die in het monster is gemengd te scheiden. Omdat elke verbinding aan het eind van de buis naar buiten komt, wordt ze geïoniseerd en krijgt ze een elektrische lading. De meeste verbindingen breken uit elkaar als ze geïoniseerd worden. De verschillende stukken vliegen onder een magneet die de stukken scheidt op basis van hun gewicht en lading. Een computer meet dan alle stukken van elke verbinding. Door de metingen te vergelijken met een computerbibliotheek van bekende verbindingen, maakt de computer een lijst met de namen van alle verbindingen in het monster. De computer kan ook vertellen hoeveel van elke verbinding in het monster zat.

Instrumentatie

De GC-MS bestaat uit twee belangrijke bouwstenen: de gaschromatograaf en de massaspectrometer. De gaschromatograaf maakt gebruik van een capillaire kolom die afhankelijk is van de afmetingen van de kolom (lengte, diameter, filmdikte) en van de fasesamenstelling (bijv. 5% fenylpolysiloxaan). Het verschil in de chemische eigenschappen tussen verschillende moleculen in een mengsel zal de moleculen scheiden naarmate het monster de lengte van de kolom aflegt. De moleculen hebben een verschillende hoeveelheid tijd nodig (de zogenaamde retentietijd) om uit (elutie van) de gaschromatograaf te komen. Hierdoor kan de massaspectrometer stroomafwaarts de geïoniseerde moleculen afzonderlijk opvangen, ioniseren, versnellen, afbuigen en detecteren. De massaspectrometer doet dit door elk molecuul in geïoniseerde fragmenten te breken en deze fragmenten te detecteren met behulp van hun massa/laadverhouding.

Deze twee machines, die samen worden gebruikt, maken een veel fijnere identificatie van de stof mogelijk dan beide afzonderlijk gebruikte eenheden. Het is niet mogelijk om een bepaalde molecule met behulp van gaschromatografie of massaspectrometrie alleen nauwkeurig te identificeren. Voor het massaspectrometrieproces is normaal gesproken een zeer zuiver monster nodig. In het verleden werden bij gaschromatografie andere detectoren gebruikt, zoals een vlamionisatiedetector. Deze detectoren kunnen geen verschillende moleculen scheiden die toevallig evenveel tijd nodig hebben om door de kolom te reizen. (Wanneer twee verschillende moleculen dezelfde retentietijd hebben, wordt er gezegd dat ze "co-elueren"). De co-eluterende moleculen zullen de computerprogramma's die een enkel massaspectrum voor beide moleculen uitlezen, in verwarring brengen.

Soms hebben twee verschillende moleculen ook een vergelijkbaar patroon van geïoniseerde fragmenten in een massaspectrometer (massaspectrum). Het combineren van de twee processen vermindert de kans op fouten. Het is uiterst onwaarschijnlijk dat twee verschillende moleculen zich op dezelfde manier zullen gedragen in zowel een gaschromatograaf als een massaspectrometer. Daarom kan, als een massaspectrum overeenkomt met de betreffende analyt, de retentietijd van dat spectrum worden gecontroleerd aan de hand van een kenmerkende GC-retentietijd om het vertrouwen dat de analyt in het monster zit, te vergroten.

Soorten massaspectrometerdetectoren

Het meest voorkomende type MS dat met een GC wordt geassocieerd is de quadrupool-massaspectrometer. Hewlett-Packard (nu Agilent) brengt het op de markt onder de handelsnaam "Mass Selective Detector" (MSD). Een andere relatief veel voorkomende detector is de ionenval-massaspectrometer. Daarnaast kan men een magnetische sector massaspectrometer vinden. Deze specifieke instrumenten zijn echter duur en omvangrijk en worden meestal niet gevonden in servicelaboratoria met een hoge doorvoersnelheid. Andere detectoren worden gebruikt zoals time of flight (TOF), tandem quadrupoles (MS-MS) (zie hieronder), of in het geval van een ionenval MSn. De n geeft het aantal massaspectrometriefasen aan.

De binnenkant van de GC-MS, met rechts de kolom van de gaschromatograaf in de oven.


GC-MS schema

Analyse

Een massaspectrometer wordt meestal op twee manieren gebruikt: Full Scan of Selective Ion Monitoring (SIM). De typische GC-MS kan in beide richtingen werken, of beide tegelijk.

Volledige scan MS

Bij het verzamelen van gegevens in de volledige scanmodus wordt een doelbereik van massafragmenten geselecteerd en in de methode van het instrument gezet. Een voorbeeld van een typisch breed bereik van massafragmenten om te monitoren is m/z 50 tot m/z 400. De bepaling van het te gebruiken bereik wordt grotendeels bepaald door wat men in het monster verwacht, terwijl men zich bewust is van het oplosmiddel en andere mogelijke interferenties. Als een MS op zoek gaat naar massafragmenten met een zeer lage m/z, kan hij lucht of andere mogelijke storende factoren detecteren. Het gebruik van een groot scanbereik vermindert de gevoeligheid van het instrument. Het apparaat zal minder scans per seconde uitvoeren omdat elke scan meer tijd vergt om een groter bereik aan massafragmenten te detecteren.

Een volledige scan is nuttig bij het bepalen van onbekende verbindingen in een monster. Het geeft meer informatie dan SIM als het gaat om het bevestigen of oplossen van verbindingen in een monster. De meeste instrumenten worden bestuurd door een computer die een computerprogramma aanstuurt dat een "instrumentmethode" wordt genoemd. De instrumentmethode regelt de temperatuur in de GC, de scansnelheid van de MS en het bereik van de gedetecteerde fragmenten. Wanneer een chemicus een instrumentmethode ontwikkelt, stuurt de chemicus testoplossingen door de GS-MS in de volledige scanmodus. Dit controleert de GC-retentietijd en de massafragmentatie vingerafdruk alvorens over te gaan naar een SIM-instrumentenmethode. Gespecialiseerde GC-MS instrumenten, zoals explosiedetectoren, hebben in de fabriek een instrumentmethode voorgeïnstalleerd.

Geselecteerde ionenbewaking

Bij geselecteerde ionenmonitoring (SIM) richt de instrumentmethode zich op bepaalde ionenfragmenten. Alleen die massafragmenten worden door de massaspectrometer gedetecteerd. De voordelen van SIM zijn dat de detectielimiet lager is omdat het instrument slechts naar een klein aantal fragmenten (bijvoorbeeld drie fragmenten) kijkt tijdens elke scan. Er kunnen meer scans per seconde plaatsvinden. Omdat er slechts een paar massafragmenten van belang worden gemonitord, zijn de matrixinterferenties doorgaans lager. Om de kans op het correct aflezen van een positief resultaat te vergroten, zijn de ionratio's van de verschillende massafragmenten vergelijkbaar met een bekende referentiestandaard.

Soorten ionisatie

Nadat de moleculen de lengte van de kolom hebben afgelegd, door de transferlijn zijn gegaan en in de massaspectrometer zijn gekomen, worden ze op verschillende manieren geïoniseerd. Meestal wordt slechts één ionisatiemethode gebruikt op een bepaald moment. Als het monster eenmaal gefragmenteerd is, wordt het gedetecteerd, meestal door een elektronenmultiplicatordiode. De diode behandelt het geïoniseerde massafragment als een elektrisch signaal dat vervolgens wordt gedetecteerd.

Scheikundigen kiezen een ionisatietechniek los van de keuze voor Full Scan of SIM-monitoring.

Elektronenionisatie

De meest voorkomende vorm van ionisatie is elektronenionisatie (EI). De moleculen komen in de MS (de bron is een quadrupool of de ionenval zelf in een ionenval MS) waar ze worden geraakt met vrije elektronen die worden uitgezonden door een gloeidraad. Dit is zoals de gloeidraad die men zou vinden in een standaard gloeilamp. De elektronen raken de moleculen, waardoor het molecuul op een karakteristieke manier versplintert, die zich kan herhalen. Deze "harde ionisatie" techniek resulteert in de creatie van meer fragmenten van lage massa/ladingsverhouding (m/z). EI heeft weinig of geen fragmenten met een massa die dicht bij de massa van het oorspronkelijke molecuul ligt. Scheikundigen beschouwen harde ionisatie als het afschieten van elektronen in de monstermoleculen. In tegenstelling, "zachte ionisatie" is het plaatsen van een lading op het monstermolecuul door het te raken met een ingebracht gas. Het moleculaire fragmentatiepatroon hangt af van de elektronenenergie die op het systeem wordt toegepast, meestal 70 eV (elektronvolt). Het gebruik van 70 eV helpt bij het vergelijken van de spectra die worden gegenereerd uit het testmonster met bekende bibliotheekspectra. (De bibliotheekspectra kunnen afkomstig zijn van door de fabrikant geleverde software of software die is ontwikkeld door het National Institute of Standards (NIST-USA)). De software zoekt de bibliotheekspectra met behulp van een matching-algoritme zoals Probability Based Matching of dot-productmatching. Veel standaardisatiebureaus hebben nu controle over deze algoritmen en methoden om hun objectiviteit te waarborgen.

Chemische ionisatie

Bij chemische ionisatie (CI) wordt een reagensgas, meestal methaan of ammoniak, in de massaspectrometer gebracht. Er zijn twee soorten CI: positieve CI of negatieve CI. In beide gevallen zal het reagensgas interageren met de elektronen en de analyt en een 'zachte' ionisatie van het betrokken molecuul veroorzaken. Een zachtere ionisatie fragmenteert het molecuul in een lagere mate dan de harde ionisatie van EI. Chemici geven de voorkeur aan CI boven EI. Dit komt omdat CI ten minste één massafragment produceert met een gewicht dat bijna gelijk is aan het molecuulgewicht van de betrokken analyt.

Positieve Chemische Ionisatie

Bij Positieve Chemische Ionisatie (PCI) heeft het reagensgas een wisselwerking met het doelmolecuul, meestal met een protonuitwisseling. Dit produceert de ionensoort in relatief grote hoeveelheden.

Negatieve Chemische Ionisatie

Bij Negatieve Chemische Ionisatie (NCI) vermindert het reagensgas het effect van de vrije elektronen op de doelanalyt. Deze verminderde energie laat het fragment meestal in grote hoeveelheden achter. (De fragmenten vallen niet verder uiteen.)

Interpretatie

Het primaire doel van de instrumentanalyse is het meten van een hoeveelheid stof. Dit gebeurt door de relatieve concentraties tussen de atoommassa's in het gegenereerde massaspectrum te vergelijken. Er zijn twee soorten analyses mogelijk, een vergelijkende en een originele. Vergelijkende analyse vergelijkt in wezen het gegeven spectrum met een spectrumbibliotheek om te zien of de kenmerken ervan aanwezig zijn voor een bekend monster in de bibliotheek. Dit kan het beste worden uitgevoerd door een computer, omdat er veel visuele vervormingen kunnen optreden als gevolg van variaties in de schaal. Computers kunnen ook meer gegevens correleren (zoals de door de GC geïdentificeerde retentietijden), om bepaalde gegevens nauwkeuriger te kunnen relateren.

Een andere analysemethode meet de pieken ten opzichte van elkaar. In deze methode wordt de hoogste piek vastgesteld op 100%. De andere pieken krijgen een waarde die gelijk is aan de verhouding tussen de piekhoogte en de hoogste piekhoogte. Alle waarden boven 3% worden toegekend. De totale massa van de onbekende verbinding wordt normaal gesproken aangegeven door de bovenliggende piek. De waarde van deze ouderpiek kan worden gebruikt om te passen met een chemische formule die de verschillende elementen bevat waarvan wordt aangenomen dat ze in de verbinding zitten. Het isotopenpatroon in het spectrum is uniek voor elementen die veel isotopen hebben. Het kan dus ook gebruikt worden om de verschillende aanwezige elementen te identificeren. Dit vertelt de totale chemische formule van het onbekende molecuul. Omdat de structuur en de bindingen van een molecuul op karakteristieke wijze uiteenvallen, kunnen ze worden geïdentificeerd aan de hand van het verschil in piekmassa's. De geïdentificeerde molecuulstructuur moet in overeenstemming zijn met de door GC-MS geregistreerde kenmerken. Typisch wordt deze identificatie automatisch uitgevoerd door computerprogramma's die met het instrument worden meegeleverd. Deze programma's vergelijken de spectra met een bibliotheek van bekende verbindingen die dezelfde lijst van elementen hebben die in het monster aanwezig zouden kunnen zijn.

Een "full spectrum" analyse beschouwt alle "pieken" binnen een spectrum. Maar, selectieve ionenmonitoring (SIM) monitort alleen geselecteerde pieken die geassocieerd zijn met een specifieke stof. Scheikundigen gaan ervan uit dat bij een bepaalde retentietijd een set ionen kenmerkend is voor een bepaalde verbinding. SIM is een snelle en efficiënte analyse. SIM werkt het beste wanneer de analist eerdere informatie over een monster heeft of slechts naar een paar specifieke stoffen zoekt. Wanneer de hoeveelheid verzamelde informatie over de ionen in een bepaalde gaschromatografische piek afneemt, neemt de gevoeligheid van de analyse toe. Met de SIM-analyse kan dus een kleinere hoeveelheid van een verbinding worden gedetecteerd en gemeten. Maar de mate van zekerheid over de identiteit van die verbinding wordt verminderd.

GC-tandem MS

Wanneer een tweede fase van massafragmentatie wordt toegevoegd, bijvoorbeeld met behulp van een tweede quadrupool in een quadrupoolinstrument, wordt dit tandem MS (MS/MS) genoemd. MS/MS zijn goed in het meten van lage niveaus van doelverbindingen in een monster met een matrix van achtergrondverbindingen die niet van belang zijn.

De eerste quadrupool (Q1) is verbonden met een botsingscel (q2) en een andere quadrupool (Q3). Beide quadrupoles kunnen worden gebruikt in de scan- of statische modus, afhankelijk van het type MS/MS-analyse dat wordt gebruikt. Soorten analyses zijn onder andere product-ionenscan, precursor-ionenscan, Selected Reaction Monitoring (SRM) en Neutral Loss Scan. Bijvoorbeeld: Wanneer Q1 in de statische modus staat (waarbij slechts naar één massa wordt gekeken zoals in SIM), en Q3 in de scanmodus staat, krijgt men een zogenaamd product-ionenspectrum (ook wel "dochterspectrum" genoemd). Uit dit spectrum kan men een prominent production selecteren dat het production kan zijn voor het gekozen voorloperion. Het paar wordt een "overgang" genoemd en vormt de basis voor SRM. SRM is zeer specifiek en elimineert bijna volledig de matrixachtergrond.

Toepassingen

Milieubewaking en -sanering

Veel chemici zijn van mening dat GC-MS het beste instrument is voor het monitoren van organische verontreinigende stoffen in het milieu. De kosten van GC-MS apparatuur zijn sterk gedaald. De betrouwbaarheid van GC-MS is tegelijkertijd toegenomen. Beide verbeteringen hebben geleid tot een toename van het gebruik in milieustudies. Sommige verbindingen, zoals bepaalde pesticiden en herbiciden, kunnen niet worden geïdentificeerd door GS-MS. Ze lijken te veel op andere verwante verbindingen. Maar voor de meeste organische analyses van milieumonsters, waaronder veel belangrijke klassen van bestrijdingsmiddelen, is GC-MS zeer gevoelig en effectief.

Strafrechtelijk forensisch onderzoek

GC-MS kan de deeltjes van een menselijk lichaam analyseren om te helpen een crimineel aan een misdrijf te koppelen. De wet accepteert het gebruik van GC-MS voor het analyseren van vuurpuin. In feite heeft de American Society for Testing Materials (ASTM) een standaard voor de analyse van brandpuin. GCMS/MS is hier vooral nuttig omdat monsters vaak zeer complexe matrices bevatten en de resultaten, die in de rechtszaal worden gebruikt, zeer nauwkeurig moeten zijn.

Rechtshandhaving

GC-MS wordt gebruikt voor het opsporen van illegale verdovende middelen, en kan op den duur in de plaats komen van drugsnuivende honden. Het wordt ook vaak gebruikt in de forensische toxicologie. Het helpt bij het vinden van drugs en/of giftige stoffen in biologische monsters van verdachten, slachtoffers of een lijk.

Beveiliging

Na de terroristische aanslagen van 11 september 2001 zijn explosievendetectiesystemen een onderdeel geworden van alle Amerikaanse luchthavens. Deze systemen draaien op een groot aantal technologieën, waarvan vele gebaseerd zijn op GC-MS. Er zijn slechts drie fabrikanten die door de FAA zijn gecertificeerd om deze systemen te leveren. De eerste is Thermo Detection (voorheen Thermedics), dat de EGIS produceert, een op GC-MS gebaseerde lijn van explosievendetectoren. De tweede is Barringer Technologies, dat nu eigendom is van Smith's Detection Systems. De derde is Ion Track Instruments (onderdeel van General Electric Infrastructure Security Systems).

Voedsel-, drank- en parfumanalyse

Voedingsmiddelen en dranken bevatten veel aromatische verbindingen, waarvan sommige van nature aanwezig zijn in de grondstoffen en sommige zich vormen tijdens de verwerking. GC-MS wordt uitgebreid gebruikt voor de analyse van deze verbindingen, waaronder esters, vetzuren, alcoholen, aldehyden, terpenen, enz. Het wordt ook gebruikt voor het opsporen en meten van verontreinigingen door bederf of vervalsing die schadelijk kunnen zijn. De verontreinigingen worden vaak gecontroleerd door overheidsinstanties, bijvoorbeeld pesticiden.

Astrochemie

Verschillende GC-MS hebben de aarde verlaten. Twee gingen naar Mars in het Vikingprogramma. Venera 11 en 12 en Pioneer Venus analyseerden de atmosfeer van Venus met GC-MS. De Huygens-sonde van de Cassini-Huygens-missie landde een GC-MS op de grootste maan van Saturnus, Titan. Het materiaal in de komeet 67P/Churyumov-Gerasimenko zal in 2014 door de Rosetta-missie worden geanalyseerd met een chiraal GC-MS.

Geneeskunde

GC-MS worden gebruikt bij de screening van pasgeborenen. Deze tests kunnen tientallen aangeboren stofwisselingsziekten (ook bekend als Inbornorn error of metabolisme-fout) vinden. GC-MS kan verbindingen in de urine bepalen, zelfs in zeer kleine hoeveelheden. Deze verbindingen zijn normaal gesproken niet aanwezig, maar komen voor bij personen die lijden aan stofwisselingsstoornissen. Dit wordt een gebruikelijke manier om IEM te diagnosticeren voor een eerdere diagnose en het begin van de behandeling. Dit leidt uiteindelijk tot een beter resultaat. Het is nu mogelijk om een pasgeborene te testen op meer dan 100 genetische metabole stoornissen door middel van een urinetest bij de geboorte op basis van GC-MS.

In combinatie met de isotopische etikettering van metabole verbindingen wordt de GC-MS gebruikt voor het bepalen van de metabole activiteit. De meeste toepassingen zijn gebaseerd op het gebruik van ^13C als labeling en het meten van ^13C-12C ratio's met een isotopenverhouding massaspectrometer (IRMS). Een IRMS is een massaspectrometer met een detector die ontworpen is om een aantal geselecteerde ionen en retourwaarden als ratio's te meten.